Не только пцр. какие бывают тесты на коронавирус и чем они отличаются

Правила подготовки для женщин и мужчин

Правила подготовки для женщин и мужчин

Достоверную информацию о наличии или отсутствии заболевания можно узнать, если соблюдать все правила подготовки к анализу. ПЦР мазок для анализа делают мужчинам и женщинам по направлению акушера, гинеколога или уролога. Материалом в данном случае служит соскоб из влагалища или уретры. В зависимости от целей диагностики на исследование забирают кровь, слюну или сперму.

Подготовка к сдаче ПЦР у мужчин и женщин во многом имеет общие черты, а также свои особенности:

• минимум за 30 дней до сдачи анализа следует прекратить приём любых препаратов, влияющих на результат (антибиотики, противовирусные, противогрибковые, противопротозойные, иммуномодуляторы)
• женщине записаться на приём к врачу нужно после месячных, не раньше, чем через 4-5 дней после последней менструации. Иногда возникают ситуации, при которых возникает вопрос: «Можно ли сдавать мазок во время месячных?». Гинекологи настоятельно не рекомендуют этого делать, чтобы избежать возможной инфекции и получить максимально точный результат;
• за два дня до процедуры следует сохранять половой покой
• подготовка к ПЦР начинается уже накануне — вечером необходимо принять ванну. Утром перед процедурой пользоваться душем нельзя, это снизит эффективность диагностических мероприятий.
• последнее мочеиспускание должно быть минимум за 2- 2.5 часа перед процедурой
• при сдаче крови запрещено употреблять пищу и пить жидкость

При соблюдении этих простых правил полученные мазки для ПЦР-исследования будут максимально информативными, и вам не придётся сдавать их вновь.

Что такое полимеразная цепная реакция

Основа анализа — амплификация (удвоение) – создание множества копий из короткого участка ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), представляющей генетический комплекс человека. Для исследования нужно очень малое количество физиологического вещества (мокрота, каловые массы, соскоб эпителия, сок простаты, кровь, сперма, околоплодные воды, слизь, ткань плаценты, моча, слюна, жидкость плевральная, цереброспинальная). При этом, например, в мочеполовом тракте больного возможно обнаружение даже единичного вредоносного микроба.

Методику ПЦР (полимеразной цепной реакции) разработал американский ученый К. Мюллисом, в 1993 получивший Нобелевскую премию.

Активно используется:

• в раннем диагностировании инфекций, генетических, онкологических патологий;
• в судебно-медицинской экспертизе при наличии для исследования крайне малого количества ДНК;
• в ветеринарной медицине, фармацевтике, биологии, молекулярной генетике;
• для идентификации личности по ДНК, подтверждения отцовства;
• в палеонтологии, антропологии, экологии (при отслеживании качества продуктов, факторов внешней среды).

Правила расшифровки результатов

Правила расшифровки результатов

Неоспоримым преимуществом метода ПЦР является его доступность, сверхточный анализ мазка и исключение ложноположительных и ложноотрицательных тестов. Все возбудители половых инфекций идентифицируются данным исследованием, вероятность ошибки составляет менее 0.5%.

ПЦР-анализ позволяет определить минимальные содержания вируса в организме. Сам аппарат распознает единичные фрагменты ДНК или РНК и многократно их копирует в пробирке, затем анализирует и выдает результат на бумагу. Если процесс копирования (репликации) генома вируса прошёл успешно, то результат будет положительным. Отрицательный же тест подтверждает отсутствие генетических структур в организме, а следовательно, и отсутствие заболеваний.

Диагностика методом ПЦР – выявление и диагностирование

Метод ПЦР – это такое исследование, которое выявляет фактически весь спектр возбудителей вирусного и бактериального характера. Полимеразная реакция, как диагностика заболеваний у мужчин, женщин и детей, показывает результаты исследований в различных областях медицины: гинекологии, урологии, терапии и так далее.

В частности, при сдаче крови идентифицируют такие заболевания:

• гепатиты вирусного характера: А, В, С и D, ТТ – сдается кровь;
• цитомегаловирус;
• ВИЧ;
• вирусы герпеса (обнаруживаются не только у мужчин и женщин, но и у детей соскоб показывает результат);
• опоясывающий лишай;
• инфекция энтеровирусная;
• токсоплазмоз;
• краснуху;
• коклюш;
• листериоз (сдается соскоб тканей лимфоузлов, кровь, околоплодные воды и т.д.) и прочее.

Стоит отметить, что цитомегаловирус является бессимптомным заболеванием. То есть человек со здоровой иммунной системой может носить в организме цитомегаловирус без знания проблемы заболевания. Цитомегаловирус наделен 60-тидневным инкубационным периодом. Запущенная форма болезни опасна для мужчин, при беременности, и порождает, как цепная реакция, энцефалит, пневмонию и прочие заболевания.

Методика ПЦР выявляет коклюш – острое инфекционное заболевание дыхательных путей (верхних), опасное так же при беременности, для детей и мужчин. Коклюш передается воздушно-капельным путем. Фактически 90% людей при контакте с больным, должны сдать анализ на коклюш, поскольку инфекция отличается повышенной контагиозностью.

При беременности коклюш может вызвать асфиксию плода. У мужчин, детей, женщин при беременности коклюш в запущенном виде поражает, как цепная реакция, сердечно сосудистую систему, легкие, бронхи. Чтобы обнаружить коклюш для исследования у мужчин, женщин и деток, берется соскоб либо мазок полости рта, кровь из вены/пальца, мокрота и моча.

Кроме крови ПЦР исследует иного рода биоматериалы: фрагменты мочи, соскоб, мазки, слюну у мужчин, детей, женщин и обязательно при беременности околоплодные воды по назначению врача, ведь стоимость исследования не мала. Частные лаборатории устанавливают собственную стоимость на производимые анализы.

Диагностика типового плана крайне важна, поэтому стоимость играет меньшую роль в определении заболевания. При получении ложноотрицательных результатов с лаборатории расшифровка их уже не важна, а болезнь может быть не идентифицирована и запущена цепная реакция инфецирования всего организма.

Оценка результатов

Полученные результаты учитывают, если одновременные испытания положительных и отрицательных стандартных или контрольных образцов дают соответственно положительные и отрицательные ответы.

При необходимости определения нуклеиновой кислоты, для которой установлено предельно допустимое содержание ДНК, следует проводить сравнение с результатом ПЦР стандартного образца с соответствующей концентрацией.

Для количественного определения специфической нуклеиновой кислоты следует использовать метод ПЦР в реальном времени и стандартный образец, аттестованный в установленном порядке.

Чего «боится» ПЦР, что она умеет и как к ней подготовиться?

Как в любых других исследованиях, иной раз результаты теста оказываются ложноположительными или ложноотрицательными, где ПЦР исключением не является. Подобное может происходить в случаях:

1. Нарушения технологического процесса на одном из этапов реакции;
2. Несоблюдения правил забора материала, его хранения или транспортировки;
3. Присутствие посторонних примесей в материале.

Это говорит о том, что к ПЦР – диагностике инфекций нужно подходить внимательно, осторожно и аккуратно, иначе образцы материала могут поменять свое структурное строение или вовсе разрушиться

Этапы ПЦР-диагностики. Ложные результаты могут дать нарушения на любом из этапов исследования

ПЦР-диагностика инфекций относится к категории «золотых стандартов» среди других лабораторных методов, поэтому ее можно применить для поиска возбудителей многих заболеваний, на первый взгляд не имеющих ничего общего между собой:

• Туберкулез различной локализации, пневмония (в том числе и атипичная, вызванная хламидией);
• Детские инфекции (коревая краснуха, паротит, корь);
• Дифтерия;
• Сальмонеллез;
• Зоонозная инфекционная болезнь – листериоз (заболевание характеризуется многообразием симптомов с поражением лимфоузлов, ЦНС, внутренних органов);
• Заболевания, обусловленные проникновением вируса Эпштейн-Барра (инфекционный мононуклеоз и др.);
• Онкологическая патология, спровоцированная папилломовирусной инфекцией (ВПЧ и его типы);
• Боррелиоз (болезнь Лайма, клещевой энцефалит);
• Хеликобактерная инфекция, возбудителем которой является проживающий в желудке человека микроб Helicobacter pylori. Доказано, что хеликобактер становится причиной развития рака желудка или 12-перстной кишки;
• Кандидоз и практически все ЗППП.

ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, имеет особую значимость, поскольку заболевания, вызванные таким образом, часто длительное время протекают без каких бы то ни было клинических проявлений, зато при беременности начинают активизироваться и, таким образом, угрожать здоровью и даже жизни ребенка. Аналогично себя ведут и TORCH- инфекции. Некоторые из них («торч») относятся одновременно и к ИППП, поэтому последние требуют более подробного рассмотрения. Ознакомиться с самыми популярными методиками читатель сможет в следующих разделах статьи.

Как правильно подготовиться, чтобы получить достоверный результат?

Сразу заметим, что подготовка к ПЦР довольно простая, никаких особых усилий со стороны пациента не требующая. Нужно лишь выполнить три несложных задания:

1. Не иметь половых контактов за 24 часа до того, как сдать анализ;
2. Для забора и анализа крови из вены нужно прийти на голодный желудок, пить, кстати, тоже нельзя;
3. Сдать мочу следует ночную (утром – в стерильную баночку, приобретенную накануне в аптеке).

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ — что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

• инфекционный мононуклеоз;
• ВИЧ;
• цитомегаловирусную инфекцию;
• вирусные гепатиты G, C, B, A;
• инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
• герпетическую инфекцию;
• онкогенные вирусы;
• листериоз;
• хеликобактерную инфекцию;
• клещевой энцефалит, боррелиоз;
• туберкулез;
• кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

• беременность, которая протекает тяжело;
• острая фаза ИППП;
• если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
• поиск причин бесплодия.

Кала­

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

• за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
• исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Для забора следует использовать стерильную палочку и контейнер. Чем-либо их дополнительно протирать, ополаскивать не нужно. При сборе материала будьте осторожны, вы не должны задеть рукой внутренние стенки контейнера. Следите, чтобы в кале не было примесей мочи, нельзя использовать дополнительные вспомогательные средства для испражнения (клизма). Собирать материал нужно в день сдачи, хватит 1/3 объема контейнера. Данный метод диагностики имеет следующие преимущества:

1. Анализ способен указывать на ДНК паразита, другие же тесты могут определять только остатки их жизнедеятельности.
2. Высокая точность, будет установлен возбудитель.
3. Ультрачувствительный анализ, который способен выявить даже одну клетку вируса.
4. Результат исследования ПЦР будет готов через 4-5 часов.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

• минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
• за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
• сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
• брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Интерпретация результатов ПЦР анализа

При определении наличия ДНК (РНК) полимеразная цепная реакция считается положительной, и это точно демонстрирует наличие возбудителя.

Для диагностики вируса иммунодефицита человека и гепатитов В и С используют ПЦР с определением концентрации ДНК (РНК).

Для ДНК высокой считается концентрация 1,0 x 105 копи на такие инфекции как герпес, цитомегаловирус, ВИЧ и гепатиты, а также токсоплазмоз.

Количественная оценка ПЦР или количественный анализ экспрессии генов говорит об их активности. В результате экспрессии генов образуются определенные белки. которые и считаются в рамках количественной ПЦР в реальном времени. По результату этого исследования врач судит об инфекционной нагрузке и активности возбудителей.

При диагностике ИППП используют несколько диагностических исследований. ПЦР позволяет довольно точно определить наличие определённого возбудителя уже в продромальный период развития инфекции.

Когда симптомы больше напоминают простуду, чем конкретное заболевание. Интересно также оценить напряженность иммунного ответа макроорганизма. Для этого назначаются серологические исследования ИФА, РПГА, РИФ и прочие.

Серология показывает, сколько антител и к какому именно антигену сформировалось, какая стадия заболевания наблюдается. Существует понятие «титр антител». То есть их количество, характеризующее напряженность, то есть выраженность иммунитета. Случается, что ответы разных исследований противоречат друг другу.

ПЦР является реакцией проверки, то есть именно по её положительному результату судят о наличии возбудителя. Например, если ПЦР положительна, а мазок на флору отрицательный.

Мы считаем, что в последнем случае в материал просто не попало нужного количества микроорганизмов. Или они не окрасились по разным причинам. Если ПЦР положительна, а серологические пробы отрицательны, то организм человека не вырабатывает иммунного ответа на возбудителя.

Наблюдается состояние иммуносупрессии, что бывает:

• при ВИЧ
• при приёме специальных лекарственных препаратов после трансплантации
• при лечении аутоиммунных заболеваний
• в период выздоровления после тяжёлой болезни
• при истощении или тяжелой хронической усталости

Если ПЦР отрицательна, а серологические пробы положительны, то нужно смотреть на фракцию иммуноглобулинов. IgM характерен для острой фазы течения заболевания при первичном заражении.

В такой ситуации врач может повторить забор материала. Или ориентироваться по точному, но длительно выполняемому культуральному методу (посев культуры возбудителя на питательные среды).

Высокий титр Ig A или IgG могут свидетельствовать о хронической инфекции в стадии обострения. А их низкие титры – просто о том, что пациент перенёс данное заболевание. Именно поэтому серологические пробы не используют для контроля эффективности лечения. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка.

Цена анализа зависит от материала, использованного для ПЦР, и колеблется от 350 до 1200 рублей.

При необходимости сдать ПЦР анализы обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.

3.4.1 Положительные контроли

В качестве «положительного контроля» используют препарат ДНК искомого микроорганизма. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Размер неспецифических продуктов может быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды (участки ДНК, расположенные внутри амплифицируемой последовательности), меченные ферментными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры. Это значительно усложняет и удлиняет анализ, а его стоимость существенно увеличивается.

Примечания

1. Mullis, Kary B. et al. «Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences»
2. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
3. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. — C. 644—651.
4. Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550—1557.
5. 1 kbp (kilo base pair (англ.)) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК
6. Отжиг (англ. annealing) — гибридизация фрагментов ДНК
7. Шпилька — внутримолекулярная самокомплементарная структура
8. Димер — межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой
9. United States Patent 7,972,820. July 5, 2011. Isothermal amplification of nucleic acids on a solid support

3.3.1 Метод горизонтального электрофореза

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 — 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Однако это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.

Обеспечение качества

Используемое оборудование должно быть аттестовано в установленном порядке.

Методика на основе ПЦР для неколичественного определения должна быть охарактеризована по специфичности и аналитической чувствительности. Аналитическую чувствительность определяют как  минимальное количество целевых последовательностей (ДНК/РНК) в единице объема образца, которое может быть обнаружено в 100 % образцов при 10-кратном проведении анализа или в 95 % образцов при 24-кратном проведении анализа. Количество ДНК/РНК может быть выражено в международных единицах или числом копий.

Методика для количественного определения должна быть охарактеризована по специфичности, диапазону линейности, правильности и прецизионности. Для установления указанных характеристик используются соответствующие международные стандартные образцы, а также стандартные образцы, аттестованные в установленном порядке.

Что показывает анализ ПЦР

В качестве образца для анализа ПЦР, при котором выявляют ДНК чужеродного патогена, служит любая биологическая жидкость, ткань, выделения организма. Забор исследуемого вещества проводят в виде взятия крови из вены, соскоба из гортани, полости носа, мочеиспускательного канала, плевральной полости, шейки матки.

Перед диагностической процедурой врач объясняет пациенту, забор какого материала будет взят:

1. При обследовании на половые инфекции, производится забор выделений из половых органов, моча, мазок из уретры.
2. При анализе на герпетические инфекции, цитомегаловирус, мононуклеоз – берут на анализ мочу, мазок из зева, на гепатит, токсоплазмоз — кровь из вены.
3. С целью диагностирования различных видов поражений нервной системы проводится забор спинномозговой жидкости.
4. В пульмонологии образцы для анализа — мокрота и жидкость плевральная.
5. Когда проводят исследование возможных внутриутробных инфекций при вынашивании плода для анализа используют околоплодные воды и клетки плаценты.

Достоверность и точность анализа зависит от стерильности условий при взятии материала. Поскольку исследование ПЦР обладает высокой чувствительностью, любое загрязнение исследуемого вещества способно искажать результат.

Грамотная подготовка к сдаче биоматериала не представляет для пациентов никаких трудностей. Имеются определенные рекомендации:

• при анализе на половые инфекции:
  • исключить интимные контакты за 72 часа до сдачи материала;
  • прекратить использование любых вагинальных средств за 3 суток;
  • с вечера предыдущего дня не проводить гигиену исследуемой области;
  • исключить мочеиспускание за 3 – 4 часа при взятии пробы из уретры;
• прекратить прием антибиотиков за месяц до сдачи анализов на инфекции;
• кровь сдают утром до принятия еды и питья;
• сбор первой утренней порции мочи проводится в стерильный контейнер после тщательного интимного туалета.

О том, как проводится диагностика по методике полимеразной цепной реакции, читайте ниже.

• По возможности сдавать биоматериал для ПЦР нужно в момент обострения инфекции.
• За несколько дней до сдачи материала на исследование нужно прекратить приём лекарственных средств. При невозможности отмены нужно проконсультироваться с врачами.
• Биоматериал нужно сдавать не ранее чем по истечении суток после полового акта, лучше — 3 суток.
• В день сдачи биоматериала следует воздержаться от мочеиспускания около 2 часов до приёма у врача.

Иногда перед процедурой врач назначает провокацию — употребление острого, солёного, алкоголя. Обычно анализы берутся спустя сутки или трое суток, в зависимости от характера подозрений на заболевания.

Противоречия результатов ПЦР и ИФА

Бывают случаи, когда разные исследования дают противоречивые результаты.

Например, ПЦР отрицательный, антитела – положительный.

Наиболее частая причина такого явления состоит в том, что бактерии действительно нет в урогенитальном тракте.

Антитела обнаруживаются из-за перенесенной в прошлом инфекции.

В целом ИФА не обладает высокой специфичностью.

Ложноположительные результаты не являются редкостью для этого теста.

Но возможна и обратная ситуация.

Отрицательный ПЦР может оказаться ложным.

Например, если мазок взят не из того участка тела, где обитают бактерии.

К примеру, пациент страдает орофарингеальной гонореей.

У него гонококки обитают во рту, а мазок для ПЦР взяли из уретры.

Естественно, результаты покажут, что никаких гонококков нет.

Но в крови появятся антитела, поэтому ИФА будет положительным.

Теперь рассмотрим обратную ситуацию.

ПЦР показывает наличие инфекции, но антител нет.

Причин может быть несколько:

• исследование проведено слишком рано, антитела ещё не успели синтезироваться;
• патоген обладает низкой иммуногенностью (например, при кандидозе иммуноглобулины появляются лишь в случае осложнений);
• произошло загрязнение исследуемого материала, в него попали бактерии, которые были обнаружены в ходе ПЦР (такое случается очень редко).

Если ПЦР и ИФА вступают в противоречие, то доверять нужно скорее ПЦР.

Потому что эта методика более точная.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты встречаются очень редко.

Ложноотрицательный тест возможен, если инфекция была недавно пролечена.

Потому что в ходе ПЦР определяется ДНК не только живых, но и погибших микроорганизмов.

Но в этом случае противоречия с ИФА обычно не наблюдается.

Потому что антитела в крови сохраняются длительное время после завершения курса терапии ЗППП.

Как проводится ПЦР-диагностика коронавируса?

Поскольку COVID-19 относится к РНК-содержащим вирусам, суть ПЦР-реакции заключается в быстром прямом поиске любых остатков РНК микроба с их предварительным удвоением до цепочки ДНК.

Взятый биоматериал помещают в специальные контейнеры, маркируют, опечатывают, транспортируют в лабораторию в сопровождении медицинского работника в защитном костюме, с соблюдением техники безопасности.

В лаборатории из полученного материала выделяют фрагменты РНК-вируса, обратной транскрипцией удваивают моноцепочку РНК до ДНК – матрицы вируса, и уже ее многократно размножают, как на ксероксе, при помощи специального фермента полимеразы. Отсюда и название теста. Смысл в том, что РНК специфична, и к коронавирусной РНК можно присоединить только такую же цепочку вируса, чтобы удвоить ее.

Количество дублей может достигать 45. Затем полимеразные цепочки вновь расщепляют. В этот самый момент на стадии обратного преобразования ДНК в РНК выявляют коронавирус (или любой другой, который планировали определить). Делают это с помощью электрофореза, поскольку он позволяет увидеть все размноженные копии ДНК.

ДНК имеет отрицательный электрозаряд, поэтому притягивается к положительному полюсу и проходя через краситель меняет цвет, становится яркой. Если в биоматериале вируса нет, то и самая первая цепочка ДНК не выстроится, не за что будет зацепиться для выстраивания двойной цепи. Значит электрофорез ничего не покажет, никакого цвета не будет.

Как сдавать и через сколько готов результат

Как сдавать и через сколько готов результат

Большинство посетителей клиники испытывает лёгкий страх перед тем, как сдавать анализы. Процедура является полностью безопасной и безболезненной, количество осложнений при её проведении стремится к нулю.

Забор для лабораторной диагностики проводится по предварительной записи, ведь к визиту врача необходимо подготовиться. Легче всего подготовиться к анализу крови, никаких ограничений здесь нет.

Сдача крови осуществляется натощак, забор материала происходит из вены в объеме до 10 мл. Мазок методом ПЦР делают со слизистых шейки матки (из цервикального канала), уретры и влагалища.

Каждое предметное стекло маркируется в зависимости от отдела, откуда брали материал, латинскими буквами C, V, U и направляется в лабораторию. Сколько будет готовиться результат во многом зависит от лаборатории и её загруженности. В среднем, срок составляет двое суток. В экстренных случаях время выполнения может сократиться до нескольких часов.

Принцип действия

Необходимые компоненты

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК с помощью ферментов in vitro (в искусственных условиях). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

С помощью ПЦР обычно могут быть амплифицированные относительно короткие (до 10 kbp) участки ДНК с известными концами, в отдельных случаях могут использоваться участки в 40kbp. Для проведения простейшей ПЦР нужны следующие компоненты:

• ДНК-матрица, то есть фрагмент ДНК, содержащий ту область, которую нужно амплифицировать.
• Два праймеры, комплементарные концам необходимого фрагмента.
• Термостабильная ДНК-полимераза.
• Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T).
• Буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивает периодическую и быструю смену температуры (охлаждение и нагрев) тестовых пробирок с раствором, обычно с точностью не менее 0,1 ° C.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами (короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований). Каждый из праймеров комплементарный одной из цепей двухцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец участка, амплифицируемого.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления _(T m) комплекса праймер-матрица. Она определяется, как температура, при которой половина нуклеотидов праймера гибридизована с матрицей. _T m можно примерно определить по формуле, где _n X — количество нуклеотидов Х в праймеры. Если праймер короткий и _T m мала, то праймер может оказаться частично комплементарным к другим участкам матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления — оптимум действия полимеразы, активность которой обычно падает при температуре выше 80 ° C. Поэтому тщательный дизайн праймеров — необходимая задача, которую следует провести перед тем, как начинать ПЦР.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

• содержание GC ~ 40-60%;
• близкие _T m праймеров (отличия не более, чем на 5 ° C);
• отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров;
• желательно, чтобы на 3 ‘конце был гуанин или цитозин.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий (см рисунок 2):

1. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 ° C (или до 98 ° C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5-10 мин., Чтобы цепи ДНК разделились. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров.
2. Когда цепи разошлись, температуру снижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом (англ. Annealing). Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4-5 ° С ниже их температуру плавления. Время стадии — 0,5-2 мин.
3. ДНК-полимераза реплицирует матричный цепочку, используя праймер как затравку. Это так называемая стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Полимеразы Taq и Pfu, часто используемые активные за 72 ° C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины фрагмента амплифицируют. Средняя скорость элонгации — 1000 пар оснований в 1 мин. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечной фрагменты. Эта стадия длится 10-15 мин.